NIPBL CRISPR Activation Plasmid (m): sc-427895-ACT

Das Mausgen **Nipbl** kodiert **NIPBL**, einen Cohesin-Loading-Faktor, der den Cohesin-Komplex auf dem Chromatin positioniert, um die Kohäsion der Schwesterchromatiden, die DNA-Replikation und die Chromosomensegregation zu unterstützen. Über die Mitose hinaus trägt NIPBL zur Organisation der höhergeordneten Genomarchitektur bei und reguliert entwicklungsbezogene Transkriptionsprogramme, indem es die Enhancer–Promotor-Kommunikation beeinflusst. Über diese Funktionen wirkt es auf Signalwege, die mit Genomstabilität und Zellschicksalsentscheidungen verknüpft sind, einschließlich Reaktionen auf Replikationsstress und der Reparatur von Doppelstrangbrüchen. Eine dysregulierte NIPBL-Funktion ist mit cohesinopathie-assoziierten Phänotypen verbunden und wurde genutzt, um Mechanismen zu modellieren, die neuroentwicklungsbedingten und wachstumsbezogenen Auffälligkeiten zugrunde liegen – sowohl in vivo als auch in zellbasierten Systemen.

NIPBL Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Nipbl-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NIPBL Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Nipbl-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Nipbl-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NIPBL-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Nipbl-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NIPBL-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NIPBL-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Nipbl-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.