NIPBL Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403371-ACT

NIPBL codifica un fattore di caricamento della coesina essenziale per l’instaurazione e il mantenimento della coesione tra cromatidi fratelli e dell’organizzazione del genoma di ordine superiore. Regolando la dinamica della coesina sulla cromatina, NIPBL influenza la replicazione del DNA, le risposte al danno del DNA e la comunicazione a lunga distanza tra enhancer e promotori che modella programmi trascrizionali specifici di linea cellulare. L’alterazione della funzione di NIPBL è strettamente associata a una disregolazione dei geni dello sviluppo ed è una delle principali cause genetiche della sindrome di Cornelia de Lange, rendendolo un nodo chiave per lo studio dei meccanismi di controllo trascrizionale. Il suo ruolo nell’architettura della cromatina collega inoltre NIPBL a vie che governano la progressione del ciclo cellulare e la stabilità del genoma nelle cellule umane.

NIPBL Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NIPBL senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NIPBL Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NIPBL nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NIPBL, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NIPBL. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NIPBL nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NIPBL nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NIPBL nelle cellule tumorali con espressione di NIPBL silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.