N-Myc Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400253-ACT

MYCN codifica per il fattore di trascrizione umano N-Myc, una proteina basic helix–loop–helix con dominio leucine zipper che eterodimerizza con MAX per legarsi agli elementi regolatori E-box e coordinare ampi programmi di espressione genica. N-Myc contribuisce a regolare la progressione del ciclo cellulare, la biogenesi dei ribosomi, il metabolismo, le risposte allo stress da replicazione del DNA e lo stato di differenziamento, integrandosi con l’attività della rete MYC/MAX e tramite il reclutamento di cofattori associati alla cromatina. L’espressione deregolata di MYCN è associata a un’alterata capacità proliferativa e a programmi di linea cellulare in molteplici contesti tumorali, rendendolo un nodo ampiamente utilizzato per studiare i circuiti trascrizionali oncogeni. I suoi effetti a valle sulla trascrizione mediata da RNA polimerasi II, sull’accessibilità della cromatina e sulle vie di segnalazione dei fattori di crescita forniscono readout misurabili per la ricerca meccanicistica.

N-Myc Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MYCN senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

N-Myc Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MYCN nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MYCN, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di N-Myc. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MYCN nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da N-Myc nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via N-Myc nelle cellule tumorali con espressione di MYCN silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.