N-cadherin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400109-ACT

CDH2 codifica la N-caderina, un recettore di adesione cellula–cellula dipendente dal calcio che media il legame omofilico nelle giunzioni aderenti e organizza l’architettura dei tessuti durante lo sviluppo e il rimodellamento. Attraverso l’accoppiamento con le catenine e il citoscheletro di actina, la N-caderina regola la segnalazione dipendente dal contatto, la polarità cellulare e la migrazione, intersecando vie che influenzano la transizione epitelio–mesenchimale, la meccanotrasduzione e il crosstalk con i recettori dei fattori di crescita. Un’espressione alterata di CDH2 è associata a cambiamenti nell’invasività cellulare, nella connettività sinaptica e nelle interazioni con lo stroma, rendendolo rilevante per studi sulla progressione del cancro, la fibrosi e i processi neuroevolutivi. In quanto molecola di adesione di superficie, la N-caderina è anche utilizzata come marcatore di stati di tipo mesenchimale e della regolazione dinamica delle giunzioni cellulari in diversi modelli di cellule umane.

N-cadherin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CDH2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

N-cadherin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CDH2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CDH2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di N-cadherin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CDH2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da N-cadherin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via N-cadherin nelle cellule tumorali con espressione di CDH2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.