MICA Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-418864-ACT

MICA (MHC class I polypeptide-related sequence A) codifica una glicoproteina di superficie cellulare inducibile dallo stress che funge da ligando per il recettore attivante NKG2D sulle cellule NK e su sottopopolazioni di cellule T CD8+. Interagendo con NKG2D, MICA contribuisce ai meccanismi di sorveglianza immunitaria che rilevano stress cellulare, infezioni e trasformazione, influenzando l’attivazione citotossica e la segnalazione citochinica alla sinapsi immunologica. L’espressione di MICA è modulata dalle risposte al danno del DNA, dalle vie dello shock termico e dalla segnalazione infiammatoria, e il suo shedding o un’alterata presentazione sulla superficie può modificare l’ingaggio del recettore. Una deregolazione della segnalazione MICA–NKG2D è stata implicata nell’elusione immunitaria dei tumori, in stati infiammatori cronici e nell’attivazione immunitaria associata a malattie autoimmuni.

MICA Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MICA senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MICA Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MICA nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MICA, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MICA. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MICA nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MICA nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MICA nelle cellule tumorali con espressione di MICA silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.