METTL3 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-425096-ACT

Mettl3 codifica METTL3, il nucleo catalitico del complesso metiltransferasico dell’RNA N6-metiladenosina (m6A), che deposita marcature m6A su mRNA e altri RNA per regolare lo splicing, l’esportazione nucleare, l’efficienza di traduzione e la stabilità dell’RNA. Coordinandosi con cofattori come METTL14 e WTAP e con i “reader” e gli “eraser” dell’m6A a valle, METTL3 influenza programmi di espressione genica che controllano la progressione del ciclo cellulare, la differenziazione e le risposte allo stress. Nei sistemi murini, un’attività alterata di METTL3 è stata collegata a cambiamenti nelle decisioni di destino delle cellule ematopoietiche e immunitarie, nei processi di neurosviluppo e nella regolazione metabolica, riflettendo il suo ampio impatto sulle vie di processamento dell’RNA. Una segnalazione m6A deregolata è inoltre associata a stati trascrizionali oncogenici e infiammatori, rendendo Mettl3 un bersaglio ampiamente utilizzato per studiare il controllo epitranscrittomico di fenotipi rilevanti per la malattia.

METTL3 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Mettl3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

METTL3 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Mettl3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Mettl3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di METTL3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Mettl3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da METTL3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via METTL3 nelle cellule tumorali con espressione di Mettl3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.