MDA5 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-427977-ACT

Il gene murino Ifih1 codifica MDA5 (IFIH1), un’elicasi dell’RNA citosolica della famiglia DExD/H-box che rileva lunghi RNA a doppio filamento prodotti durante la replicazione virale e altre fonti di RNA aberrante. Dopo il legame con il ligando, MDA5 trasduce il segnale tramite l’adattatore MAVS per attivare le vie di IRF3/IRF7 e NF-κB, inducendo interferoni di tipo I e geni stimolati dagli interferoni che modulano le risposte immunitarie innate e adattative. Questo asse di sensing dell’RNA influenza la restrizione antivirale, i programmi di citochine infiammatorie e il cross-talk con l’autofagia e la dinamica dei granuli di stress. Un’attività deregolata di MDA5 e della segnalazione interferonica è stata associata a interferonopatie e a infiammazione di tipo autoimmune, ed è rilevante anche per il riconoscimento immunitario dei tumori e per le interazioni ospite–patogeno in modelli sperimentali.

MDA5 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Ifih1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MDA5 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Ifih1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Ifih1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MDA5. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Ifih1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MDA5 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MDA5 nelle cellule tumorali con espressione di Ifih1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.