Mcl-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400079-ACT

MCL1 codifica per Mcl-1, una proteina antiapoptotica della famiglia BCL-2 che si localizza principalmente sulla membrana esterna dei mitocondri e sopprime la permeabilizzazione della membrana mitocondriale esterna sequestrando fattori pro-apoptotici BH3-only e inibendo l’attivazione di BAX/BAK. La sua abbondanza è strettamente regolata tramite un rapido turnover e input di segnalazione provenienti da vie quali PI3K–AKT, MAPK/ERK e JAK/STAT, consentendo un controllo dinamico dell’apoptosi intrinseca durante proliferazione, differenziamento e risposte allo stress cellulare. Mcl-1 contribuisce anche all’omeostasi mitocondriale ed è stata collegata alla regolazione dell’autofagia e dell’adattamento metabolico. Un’espressione deregolata di MCL1 è spesso associata, nel cancro, a programmi di sopravvivenza cellulare alterati e influisce sulla resistenza a perturbazioni genotossiche e mirate, rendendolo un nodo chiave per lo studio di apoptosi, segnalazione dello stress e dipendenze di sopravvivenza.

Mcl-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MCL1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Mcl-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MCL1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MCL1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Mcl-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MCL1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Mcl-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Mcl-1 nelle cellule tumorali con espressione di MCL1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.