MAN1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404258-ACT

Il gene umano **LEMD3** codifica la proteina della membrana nucleare interna **MAN1**, un fattore con dominio LEM che collega l’architettura nucleare al controllo trascrizionale. MAN1 si lega agli SMAD regolati dai recettori e modula l’output della segnalazione **TGF-β/BMP**, influenzando programmi che regolano la matrice extracellulare, la differenziazione e l’omeostasi tissutale. Attraverso interazioni con le lamine e con complessi associati alla cromatina, MAN1 contribuisce all’organizzazione dell’involucro nucleare e alla regolazione meccanosensibile dell’espressione genica. La disregolazione dell’attività di LEMD3/MAN1 è stata associata a fenotipi del tessuto connettivo e dello scheletro ed è studiata in contesti in cui convergono alterazioni della trascrizione SMAD-dipendente e della funzione dell’involucro nucleare.

MAN1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di LEMD3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MAN1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus LEMD3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione LEMD3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MAN1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus LEMD3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MAN1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MAN1 nelle cellule tumorali con espressione di LEMD3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.