Ly-GDI/RhoGDI2/ARHGDIB Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402326-ACT

ARHGDIB codifica Ly-GDI (RhoGDI2), un inibitore della dissociazione del GDP delle Rho (Rho GDP dissociation inhibitor) arricchito nelle cellule ematopoietiche, che si lega alle GTPasi prenilate della famiglia Rho e ne controlla il ciclo di associazione alla membrana e lo stato di attivazione. Modulando la segnalazione di RAC1, RHOA e CDC42, ARHGDIB regola la dinamica del citoscheletro di actina, l’adesione cellulare, la chemiotassi e le risposte funzionali dei fagociti, centrali nella segnalazione dell’immunità innata. Questa via si interfaccia con la motilità mediata dalle integrine e con le reti di segnalazione infiammatoria che coordinano il traffico leucocitario e la sorveglianza tissutale. Una deregolazione dell’espressione di ARHGDIB è stata associata ad alterazioni della migrazione delle cellule immunitarie e a fenotipi infiammatori, ed è spesso studiata nel contesto della biologia delle neoplasie ematologiche e delle interazioni con il microambiente tumorale.

Ly-GDI/RhoGDI2/ARHGDIB Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ARHGDIB senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Ly-GDI/RhoGDI2/ARHGDIB Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ARHGDIB nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ARHGDIB, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Ly-GDI/RhoGDI2/ARHGDIB. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ARHGDIB nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Ly-GDI/RhoGDI2/ARHGDIB nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Ly-GDI/RhoGDI2/ARHGDIB nelle cellule tumorali con espressione di ARHGDIB silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.