LOX Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400973-ACT

La LOX (lisil ossidasi) umana codifica un’ammina ossidasi secreta, rame-dipendente, che catalizza la deaminazione ossidativa dei residui di lisina nel collagene e nell’elastina, generando aldeidi reattive che avviano la reticolazione covalente e stabilizzano la matrice extracellulare. Attraverso la regolazione della rigidità e dell’architettura della matrice, LOX influenza l’adesione e la migrazione cellulare, la meccanotrasduzione e i programmi di rimodellamento tissutale legati alla riparazione delle ferite e alla fibrosi. L’attività di LOX si interseca con la segnalazione responsiva all’ipossia e con le vie di organizzazione della matrice extracellulare che modellano le risposte infiammatorie e stromali. Un’espressione deregolata di LOX è stata associata al rimodellamento patologico della matrice osservato nei disturbi fibrotici e nel rimodellamento del microambiente tumorale, supportandone l’utilità come nodo meccanicistico nella biologia della matrice extracellulare.

LOX Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di LOX senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

LOX Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus LOX nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione LOX, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di LOX. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus LOX nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da LOX nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via LOX nelle cellule tumorali con espressione di LOX silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.