LIN-28B Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402851-ACT

LIN28B umano codifica la proteina legante l’RNA LIN-28B, un regolatore eterocronico che sopprime la maturazione della famiglia di microRNA let-7 e, di conseguenza, rimodella i programmi di regolazione genica post-trascrizionale che controllano proliferazione, metabolismo e impegno di linea cellulare. Modulando le reti dipendenti da let-7, LIN-28B influenza la tempistica dello sviluppo, gli stati cellulari di tipo staminale e la riprogrammazione cellulare, intersecandosi con vie associate agli output di segnalazione MYC, RAS/MAPK e mTOR. Un’attività deregolata di LIN28B è stata associata ad alterazioni della differenziazione e a un controllo anomalo della crescita in molteplici contesti rilevanti per la malattia, inclusi programmi trascrizionali oncogenici e disturbi dello sviluppo pediatrici. Queste caratteristiche rendono LIN28B un nodo utile per studiare la biogenesi dei miRNA, il metabolismo dell’RNA e i circuiti di regolazione genica nelle cellule umane.

LIN-28B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di LIN28B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

LIN-28B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus LIN28B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione LIN28B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di LIN-28B. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus LIN28B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da LIN-28B nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via LIN-28B nelle cellule tumorali con espressione di LIN28B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.