KV4.3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404247-ACT

KCND3 codifica per la subunità umana del canale del potassio voltaggio-dipendente KV4.3, uno dei principali mediatori delle correnti di potassio di tipo A rapide e transitorie, che modellano la ripolarizzazione del potenziale d’azione e la frequenza di scarica. La funzione di KV4.3 si integra con le reti che regolano l’eccitabilità di membrana in neuroni e cardiomiociti, influenzando l’integrazione sinaptica, la dinamica della conduzione e la segnalazione dipendente dall’attività. Modulando la cinetica di ripolarizzazione e le soglie di eccitabilità, KCND3 si interseca con vie che governano la segnalazione elettrica, l’accoppiamento con il calcio e i programmi trascrizionali a valle sensibili alla depolarizzazione. Alterazioni genetiche e funzionali di KCND3 sono state associate a disturbi dell’eccitabilità, inclusi fenotipi neurologici come l’atassia spinocerebellare e anomalie dell’attività elettrica cardiaca, a supporto della sua rilevanza in studi orientati ai meccanismi.

KV4.3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KCND3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

KV4.3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KCND3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KCND3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di KV4.3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KCND3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da KV4.3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via KV4.3 nelle cellule tumorali con espressione di KCND3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.