KRAS Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-421333-ACT

Kras codifica la piccola GTPasi KRAS, un interruttore molecolare centrale che trasduce i segnali provenienti dalle tirosin-chinasi recettoriali attivate verso le vie a valle RAF–MEK–ERK e PI3K–AKT–mTOR. Alternando ciclicamente gli stati legati a GDP e a GTP, KRAS regola proliferazione, differenziamento, sopravvivenza e adattamento metabolico, sotto uno stretto controllo da parte di GEF e GAP. Una segnalazione di KRAS deregolata altera il controllo del ciclo cellulare e i programmi di risposta allo stress ed è ampiamente utilizzata nei modelli murini per interrogare le reti di segnalazione oncogeniche, l’omeostasi tissutale e le interazioni tra tumore e microambiente. Poiché KRAS integra molteplici segnali a monte e coordina ampie risposte trascrizionali e post-traduzionali, rappresenta un nodo chiave per la mappatura delle vie di segnalazione e per studi di epistasi.

KRAS Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Kras senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

KRAS Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Kras nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Kras, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di KRAS. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Kras nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da KRAS nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via KRAS nelle cellule tumorali con espressione di Kras silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.