KCC4 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-422974-ACT

Slc12a7 codifica il cotrasportatore K+-Cl− KCC4 (SLC12A7) del topo, un regolatore chiave dell’estrusione elettroneutra di cloruro che contribuisce a determinare i livelli intracellulari di Cl−, il volume cellulare e l’omeostasi ionica. Modellando i gradienti di Cl−, KCC4 influenza l’eccitabilità di membrana e la segnalazione inibitoria e si interseca con le risposte allo stress osmotico e con programmi di rimodellamento del citoscheletro legati a migrazione e invasione cellulare. L’attività di KCC4 è inoltre accoppiata al trasporto ionico epiteliale e alla regolazione di pH/volume, processi che possono influenzare la funzione di barriera dei tessuti e la segnalazione del microambiente. Un’espressione deregolata di SLC12A7 è stata associata ad alterazioni della motilità e a fenotipi di rimodellamento in contesti rilevanti per la malattia, supportandone l’impiego in studi meccanicistici sui comportamenti cellulari dipendenti dal trasporto ionico.

KCC4 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Slc12a7 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

KCC4 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Slc12a7 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Slc12a7, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di KCC4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Slc12a7 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da KCC4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via KCC4 nelle cellule tumorali con espressione di Slc12a7 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.