KCC2 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-425338-ACT

Slc12a5 codifica il cotrasportatore neuronale K+-Cl− KCC2, un determinante chiave dell’omeostasi del cloruro intracellulare che consente l’inibizione iperpolarizzante GABAergica e glicinergica nel sistema nervoso centrale maturo. Espellendo Cl−, KCC2 sostiene la trasmissione sinaptica inibitoria, regola l’eccitabilità neuronale e influenza la maturazione sinaptica dipendente dall’attività e lo sviluppo delle spine dendritiche. La funzione di KCC2 si intreccia con vie di segnalazione dipendenti dalla fosforilazione e con processi di traffico di membrana che modulano la stabilità del trasportatore in superficie e la capacità di trasporto durante lo sviluppo e la plasticità. Un’alterata espressione o regolazione di KCC2 è collegata a uno squilibrio tra eccitazione e inibizione ed è stata associata all’epilessia, al dolore neuropatico, a fenotipi correlati ai disturbi dello spettro autistico e ad altri contesti di ricerca neuroevolutiva e neuropsichiatrica.

KCC2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Slc12a5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

KCC2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Slc12a5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Slc12a5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di KCC2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Slc12a5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da KCC2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via KCC2 nelle cellule tumorali con espressione di Slc12a5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.