IRBP Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403810-ACT

RBP3 codifica la interphotoreceptor retinoid-binding protein (IRBP), una glicoproteina secreta arricchita nella matrice interfotorecettoriale, dove lega e trasporta i retinoidi tra i fotorecettori e l’epitelio pigmentato retinico (RPE) per sostenere il ciclo visivo (dei retinoidi). Regolando la disponibilità e il traffico dei retinoidi 11-cis e all-trans, IRBP contribuisce a mantenere l’omeostasi dei fotorecettori e influenza le risposte allo stress ossidativo e metabolico nella retina esterna. Alterazioni dell’espressione o della funzione di RBP3/IRBP sono associate a fenotipi di disfunzione e degenerazione retinica, rendendolo un utile strumento molecolare per studiare l’accoppiamento fotorecettori–RPE, la biologia della matrice extracellulare e la segnalazione dipendente dai retinoidi. RBP3 è quindi comunemente studiato in modelli di malattie retiniche ereditarie e acquisite per analizzare i meccanismi dello squilibrio del ciclo visivo e della vulnerabilità dei fotorecettori.

IRBP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RBP3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

IRBP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RBP3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RBP3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di IRBP. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RBP3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da IRBP nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via IRBP nelle cellule tumorali con espressione di RBP3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.