HSPA5/BiP/GRP78 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400073-ACT

HSPA5 codifica per lo chaperone del reticolo endoplasmatico (RE) BiP/GRP78, un regolatore centrale del ripiegamento proteico, del controllo qualità nel RE e della proteostasi. HSPA5 si lega ai polipeptidi nascenti e alle proteine mal ripiegate, coordina la degradazione associata al RE (ERAD) e modula la segnalazione della risposta alle proteine mal ripiegate (UPR) tramite sensori chiave tra cui PERK, IRE1 e ATF6. Integrando lo stress del RE con l’omeostasi del calcio, l’equilibrio redox e la capacità della via secretoria, HSPA5 influenza la sopravvivenza cellulare e l’adattamento metabolico. Un’espressione deregolata di HSPA5 e l’attivazione della UPR sono implicate nella tolleranza allo stress nei tumori, nelle proteinopatie neurodegenerative, nello stress del RE correlato al diabete e in stati infiammatori.

HSPA5/BiP/GRP78 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HSPA5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HSPA5/BiP/GRP78 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HSPA5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HSPA5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HSPA5/BiP/GRP78. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HSPA5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HSPA5/BiP/GRP78 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HSPA5/BiP/GRP78 nelle cellule tumorali con espressione di HSPA5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.