HPS-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404200-ACT

HPS1 codifica HPS-1, un componente fondamentale del complesso 3 per la biogenesi degli organelli correlati ai lisosomi (BLOC-3), che regola il traffico endosomiale e la maturazione di compartimenti secretori specializzati. Grazie al suo ruolo di fattore di scambio di nucleotidi della guanina (GEF) per Rab32 e Rab38, HPS-1 contribuisce a coordinare la consegna dei carichi ai lisosomi e agli organelli correlati ai lisosomi, influenzando la formazione dei melanosomi, la biogenesi dei granuli densi piastrinici e le dinamiche vescicolari correlate. L’alterazione di HPS1 compromette la biogenesi degli organelli e il trasporto di membrana, fornendo un collegamento meccanicistico con i fenotipi della sindrome di Hermansky–Pudlak, che includono difetti di pigmentazione e diatesi emorragica. Queste funzioni rendono HPS1 un nodo utile per studiare le vie endolisosomiali, la regolazione delle GTPasi Rab e lo smistamento di carichi specifici per organello nelle cellule umane.

HPS-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HPS1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HPS-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HPS1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HPS1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HPS-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HPS1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HPS-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HPS-1 nelle cellule tumorali con espressione di HPS1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.