HOOK1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404872-ACT

HOOK1 umano codifica una proteina adattatrice legante i microtubuli che collega i motori dineina–dynactina ai carichi endosomiali e di organelli, supportando il trasporto diretto verso l’estremità meno e l’organizzazione spaziale del traffico di membrana. Attraverso il suo ruolo nelle dinamiche dipendenti dai microtubuli, HOOK1 contribuisce a processi associati al centrosoma, all’assemblaggio e al mantenimento delle ciglia e al coordinamento delle vie di traffico dagli endosomi all’apparato di Golgi. L’alterazione del trasporto regolato da HOOK1 può influenzare la polarità cellulare, la progressione mitotica e la compartimentalizzazione dei segnali, rendendolo rilevante per studi di biologia del neurosviluppo, dei meccanismi legati alle ciliopatie e del traffico intracellulare deregolato osservato in diversi contesti patologici. Alterazioni dell’espressione o della funzione di HOOK1 sono state inoltre indagate in relazione al comportamento delle cellule tumorali e alle vie di stabilità del genoma che dipendono da una corretta organizzazione del citoscheletro.

HOOK1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HOOK1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HOOK1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HOOK1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HOOK1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HOOK1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HOOK1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HOOK1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HOOK1 nelle cellule tumorali con espressione di HOOK1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.