Plasmide CRISPR d'Activation (h) HNF-6: sc-401082-ACT

ONECUT1 code le facteur de transcription HNF-6, une protéine à homéodomaine qui coordonne des programmes géniques spécifiques aux tissus au cours du développement endodermique et dans le maintien de l’homéostasie épithéliale à l’âge adulte. Dans les cellules humaines, HNF-6 intègre des signaux provenant des promoteurs et des enhancers pour réguler la spécification de lignée et les voies de différenciation, avec des rôles marqués dans les réseaux transcriptionnels hépatiques et pancréatiques ainsi que dans la morphogenèse épithéliale. En modulant l’expression de gènes métaboliques, sécrétoires et d’identité cellulaire, ONECUT1 influence des processus tels que l’organogenèse, le maintien du destin cellulaire et le contrôle transcriptionnel en réponse au stress. Une activité dérégulée de ONECUT1/HNF-6 a été associée à des états de différenciation altérés et à un remaniement transcriptionnel observé dans des contextes de maladies métaboliques et épithéliales, ce qui en fait un nœud pertinent pour des études mécanistiques des circuits de régulation génique.

HNF-6 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ONECUT1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

HNF-6 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ONECUT1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ONECUT1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de HNF-6. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ONECUT1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de HNF-6 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie HNF-6 dans les cellules tumorales présentant une expression de ONECUT1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.