HNF-6 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401082-ACT

ONECUT1 codifica il fattore di trascrizione HNF-6, una proteina con homeodominio che coordina programmi genici specifici di tessuto durante lo sviluppo endodermico e l’omeostasi dell’epitelio adulto. Nelle cellule umane, HNF-6 integra segnali provenienti da promotori ed enhancer per regolare la specificazione di linea e i percorsi di differenziamento, con ruoli di rilievo nelle reti trascrizionali epatiche e pancreatiche e nella morfogenesi epiteliale. Modulando l’espressione di geni metabolici, secretori e dell’identità cellulare, ONECUT1 influenza processi quali l’organogenesi, il mantenimento del destino cellulare e il controllo trascrizionale in risposta allo stress. Un’attività deregolata di ONECUT1/HNF-6 è stata associata a stati di differenziamento alterati e a un rimodellamento trascrizionale osservato in contesti di patologie metaboliche ed epiteliali, a supporto della sua utilità come nodo per studi meccanicistici dei circuiti di regolazione genica.

HNF-6 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ONECUT1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HNF-6 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ONECUT1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ONECUT1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HNF-6. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ONECUT1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HNF-6 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HNF-6 nelle cellule tumorali con espressione di ONECUT1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.