HNF-3β Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-420890-ACT

Foxa2 codifica il fattore nucleare degli epatociti 3 beta (HNF-3β), un fattore di trascrizione della famiglia forkhead box che, nel topo, agisce come regolatore “pioniere” dell’accessibilità della cromatina durante le prime fasi dell’embriogenesi e la specificazione dell’endoderma. HNF-3β coordina programmi trascrizionali che controllano la differenziazione epiteliale epatica, pancreatica e polmonare, con ruoli ben consolidati nell’omeostasi metabolica, nelle reti geniche regolatrici degli acidi biliari e del glucosio e nell’identità epiteliale. Attraverso l’interazione con la segnalazione dei recettori nucleari e con circuiti trascrizionali dello sviluppo, Foxa2 influenza l’impegno di destino di linea, la morfogenesi e il rimodellamento tissutale. La deregolazione dell’espressione genica associata a Foxa2 è stata collegata a difetti dello sviluppo e a fenotipi metabolici alterati, a supporto del suo impiego come nodo meccanicistico negli studi sulla differenziazione e sul metabolismo.

HNF-3β Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Foxa2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HNF-3β Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Foxa2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Foxa2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HNF-3β. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Foxa2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HNF-3β nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HNF-3β nelle cellule tumorali con espressione di Foxa2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.