HNF-3α Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400743-ACT

FOXA1 (HNF-3α) è un fattore di trascrizione “pioniere” della famiglia forkhead che si lega alla cromatina compattata per stabilire paesaggi regolatori accessibili e coordinare programmi di espressione genica specifici di linea cellulare. Nei tessuti epiteliali umani integra la segnalazione dei recettori ormonali con reti trascrizionali che controllano differenziamento, metabolismo e progressione del ciclo cellulare, includendo un ampio crosstalk con vie dei recettori nucleari, come la trascrizione dipendente dai recettori degli estrogeni e degli androgeni. L’attività di FOXA1 influenza la selezione degli enhancer e il rimodellamento della cromatina, plasmando processi di sviluppo e omeostasi in fegato, polmone, pancreas ed epitelio mammario. Un’espressione deregolata di FOXA1 o profili di legame alla cromatina alterati sono spesso oggetto di studio nei tumori ormono-dipendenti e in altre patologie caratterizzate da un’identità epiteliale perturbata e da riprogrammazione trascrizionale.

HNF-3α Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FOXA1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HNF-3α Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FOXA1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FOXA1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HNF-3α. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FOXA1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HNF-3α nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HNF-3α nelle cellule tumorali con espressione di FOXA1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.