HBXIP Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405228-ACT

LAMTOR5 codifica HBXIP (hepatitis B virus X-interacting protein), un adattatore endosomiale/lisosomiale noto soprattutto come componente del complesso Ragulator, che contribuisce ad accoppiare il rilevamento degli amminoacidi all’attivazione di mTORC1 sulla superficie lisosomiale. Attraverso la regolazione della segnalazione responsiva ai nutrienti, HBXIP influenza la crescita cellulare, l’autofagia e l’adattamento metabolico, ed è stato anche collegato al controllo della progressione del ciclo cellulare e di programmi trascrizionali. Un’espressione deregolata di HBXIP o l’alterazione del suo coinvolgimento in queste vie è stata associata a segnali proliferativi e risposte allo stress modificati, riportati in diversi contesti rilevanti per il cancro. Di conseguenza, LAMTOR5/HBXIP è spesso studiato nei meccanismi che collegano hub di segnalazione incentrati sul lisosoma al metabolismo oncogenico, alla proteostasi e al traffico intracellulare.

HBXIP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di LAMTOR5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HBXIP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus LAMTOR5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione LAMTOR5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HBXIP. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus LAMTOR5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HBXIP nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HBXIP nelle cellule tumorali con espressione di LAMTOR5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.