HARE Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405069-ACT

STAB2 codifica il recettore dell’ialuronano per l’endocitosi (HARE), un recettore “scavenger” espresso prevalentemente sulle cellule endoteliali sinusoidali del fegato, che media la rimozione ad alta capacità dei glicosaminoglicani circolanti, come ialuronano, eparina e solfati di condroitina. HARE partecipa all’endocitosi mediata da recettore e al traffico lisosomiale, collegando il turnover della matrice extracellulare all’omeostasi vascolare ed epatica. Regolando l’assorbimento dei ligandi e le risposte di segnalazione a valle ai polimeri derivati dalla matrice, STAB2/HARE contribuisce ai processi infiammatori e fibrotici ed è spesso studiato nel contesto della biologia delle patologie epatiche, del rimodellamento vascolare associato all’aterosclerosi e delle dinamiche della matrice nel microambiente tumorale.

HARE Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di STAB2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HARE Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus STAB2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione STAB2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HARE. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus STAB2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HARE nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HARE nelle cellule tumorali con espressione di STAB2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.