GTPBP4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-408845-ACT

Il GTPBP4 umano codifica una NTPasi P-loop nucleolare che si associa a particelle pre-ribosomiali e supporta la maturazione della grande subunità ribosomiale 60S. Attraverso i suoi ruoli nel processamento dell’rRNA e nella biogenesi dei ribosomi, GTPBP4 influenza la capacità di traduzione, la proteostasi e la progressione del ciclo cellulare in condizioni di crescita e di stress. L’alterazione della funzione nucleolare e dell’assemblaggio ribosomiale è un segno distintivo di molteplici stati proliferativi e di risposta allo stress, rendendo GTPBP4 un nodo utile per analizzare i legami tra sorveglianza nucleolare, segnalazione associata a p53 e controllo globale della traduzione. Una regolazione anomala dei fattori della biogenesi ribosomiale, incluse GTPasi come GTPBP4, è stata collegata in letteratura a programmi oncogenici e a una fitness cellulare alterata, a supporto della sua rilevanza per studi meccanicistici in modelli di malattia.

GTPBP4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GTPBP4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GTPBP4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GTPBP4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GTPBP4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GTPBP4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GTPBP4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GTPBP4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GTPBP4 nelle cellule tumorali con espressione di GTPBP4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.