G_{γ 10} Particelle di Attivazione Lentivirale (m2): sc-420613-LAC-2

Nel topo, Gng10 codifica la subunità γ10 delle proteine G eterotrimeriche, un componente ancorato alla membrana della segnalazione mediata dai GPCR che si assembla con le subunità Gβ per formare complessi Gβγ che controllano la propagazione del segnale dipendente dal recettore. Il complesso Gβγ derivato da eterotrimeri contenenti GNG10 modula effettori quali canali ionici, adenilil ciclasi e fosfolipasi Cβ, plasmando le vie dei secondi messaggeri che regolano l’eccitabilità neuronale, la secrezione e la dinamica del citoscheletro. Alterazioni nella composizione delle subunità delle proteine G e nella segnalazione mediata da Gβγ sono state implicate in disturbi che coinvolgono il neurosviluppo e l’elaborazione sensoriale, oltre che in una migrazione e proliferazione cellulare disregolate, rendendo Gng10 un bersaglio rilevante per studi meccanicistici. L’editing genetico di Gng10 in modelli murini supporta la dissezione delle vie nelle reti dei GPCR, la mappatura delle interazioni proteina–proteina all’interno dei complessi delle proteine G e screening di genomica funzionale che collegano gli input recettoriali a fenotipi trascrizionali ed elettrofisiologici a valle.

Le particelle di attivazione lentivirale Gγ 10 (m2) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di Gng10 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale Gγ 10 (m2) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione Gng10, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di Gγ 10. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo Gng10 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.