GSDMDC1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-427312-ACT

Gsdmd codifica la gasdermina D (GSDMDC1), un effettore che forma pori coinvolto nella morte cellulare infiammatoria, attivato dalla scissione proteolitica a valle della segnalazione dell’inflammasoma canonico e non canonico. Una volta clivato dalla caspasi-1 o dalla caspasi-11, il frammento N-terminale oligomerizza nella membrana plasmatica formando pori, promuovendo la piroptosi e facilitando il rilascio di citochine come IL-1β e IL-18. Questa attività collega il rilevamento immunitario innato alla lisi cellulare e alle risposte di riparazione della membrana, integrandosi con vie che controllano la maturazione delle citochine, il rilascio di alarmini e la difesa antimicrobica. Un’attività deregolata della gasdermina D è implicata in modelli murini di autoinfiammazione, di infiammazione sistemica tipo sepsi e in contesti di danno tissutale in cui la morte cellulare guidata dall’inflammasoma modella la segnalazione immunitaria associata alla malattia.

GSDMDC1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Gsdmd senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GSDMDC1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Gsdmd nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Gsdmd, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GSDMDC1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Gsdmd nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GSDMDC1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GSDMDC1 nelle cellule tumorali con espressione di Gsdmd silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.