GlyRS Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404105-ACT

GARS codifica la glicil‑tRNA sintetasi umana (GlyRS), una aminoacil‑tRNA sintetasi citosolica che lega la glicina al proprio tRNA cognato per garantire la fedeltà della traduzione. Attraverso il suo ruolo essenziale nel caricamento dei tRNA, GlyRS sostiene la sintesi proteica globale, la proteostasi e le risposte allo stress cellulare legate alla domanda di traduzione. Alterazioni dell’attività delle tRNA sintetasi sono associate a fenotipi neuromuscolari e dei nervi periferici, rendendo GARS un nodo utile per studiare i meccanismi che collegano il controllo della traduzione al mantenimento neuronale. L’espressione e la funzione di GARS sono inoltre rilevanti per il coordinamento mito‑citosolico dell’omeostasi proteica e per l’adattamento cellulare allo stress metabolico o proteotossico.

GlyRS Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GARS senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GlyRS Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GARS nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GARS, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GlyRS. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GARS nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GlyRS nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GlyRS nelle cellule tumorali con espressione di GARS silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.