GIP Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402545-ACT

Il GIP umano codifica il polipeptide insulinotropo glucosio‑dipendente, un ormone incretinico prodotto dalle cellule K enteroendocrine che amplifica la secrezione di insulina stimolata dal glucosio e influenza il rilascio di glucagone, la motilità gastrica e la gestione dei nutrienti. La segnalazione del GIP attraverso il recettore del GIP attiva cAMP/PKA e programmi trascrizionali a valle che coordinano la funzione delle isole pancreatiche e l’equilibrio energetico sistemico. La disregolazione dell’attività dell’asse del GIP è implicata in fenotipi metabolici, tra cui risposte incretiniche compromesse, alterazioni del metabolismo lipidico del tessuto adiposo e insulino‑resistenza associata all’obesità, rendendo il GIP un nodo utile per studiare la comunicazione entero‑insulare. La modulazione sperimentale dell’espressione di GIP supporta studi meccanicistici sul cross‑talk tra ormoni delle isole, sulle vie di nutrient sensing e sulle risposte allo stress metabolico in modelli cellulari pertinenti.

GIP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GIP senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GIP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GIP nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GIP, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GIP. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GIP nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GIP nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GIP nelle cellule tumorali con espressione di GIP silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.