GCN5 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400767-ACT

KAT2A umano codifica per GCN5, una acetiltransferasi delle lisine che catalizza l’acetilazione dell’istone H3 (inclusi H3K9 e H3K14) favorendo una cromatina aperta e la competenza trascrizionale. GCN5 agisce all’interno di complessi coattivatori multisuunità come SAGA e ATAC, accoppiando l’acetilazione degli istoni ai programmi di inizio e allungamento della trascrizione che regolano la progressione del ciclo cellulare, le risposte al danno del DNA e l’espressione genica specifica di linea cellulare. Attraverso l’acetilazione di substrati istonici e non istonici, KAT2A integra segnali a monte nel controllo della proliferazione e della differenziazione mediato dalla cromatina. Un’attività alterata di KAT2A/GCN5 e la conseguente disregolazione epigenetica sono implicate in reti trascrizionali oncogeniche e in altre patologie associate a un rimodellamento anomalo della cromatina.

GCN5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KAT2A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GCN5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KAT2A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KAT2A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GCN5. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KAT2A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GCN5 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GCN5 nelle cellule tumorali con espressione di KAT2A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.