GCN2 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-424196-ACT

Il gene murino Eif2ak4 codifica GCN2, una chinasi proteica serina/treonina che rileva la carenza di amminoacidi legandosi ai tRNA non caricati e avvia la risposta integrata allo stress. Una volta attivata, GCN2 fosforila eIF2α riducendo la traduzione globale, ma promuovendo programmi di traduzione selettivi come la trascrizione dipendente da ATF4, collegando lo stress nutrizionale al metabolismo adattativo e al controllo redox. Questa via di segnalazione interseca il signaling di mTORC1, la regolazione dell’autofagia e il controllo qualità associato ai ribosomi durante le sfide alla proteostasi. Una deregolazione della segnalazione di GCN2 è stata implicata in fenotipi infiammatori e metabolici, nelle risposte allo stress associate alla neurodegenerazione e nell’adattamento delle cellule tumorali a microambienti poveri di nutrienti, sostenendone l’impiego in studi meccanicistici della biologia dello stress.

GCN2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Eif2ak4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GCN2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Eif2ak4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Eif2ak4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GCN2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Eif2ak4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GCN2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GCN2 nelle cellule tumorali con espressione di Eif2ak4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.