GCET2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-418185-ACT

GCSAM (noto anche come GCET2) è una proteina adattatrice associata ai linfociti, arricchita nelle cellule B del centro germinativo e in altre linee ematopoietiche, dove sostiene gli output di segnalazione legati all’attivazione del recettore delle cellule B e al rimodellamento del citoscheletro. Collegando segnali prossimali al recettore alla dinamica dell’actina e al comportamento migratorio, GCET2 è stata implicata nella regolazione dell’attivazione delle cellule immunitarie, dell’adesione e del traffico all’interno dei microambienti linfoidi. Sono stati riportati pattern di espressione alterati in contesti di neoplasie a cellule B, rendendo questo gene un marcatore utile e un nodo meccanicistico per lo studio delle vie che modellano la biologia del centro germinativo e la trasformazione maligna. L’analisi funzionale di GCSAM aiuta a collegare gli stati trascrizionali a variazioni nell’ampiezza della segnalazione, nella motilità cellulare e nelle interazioni con il microambiente immunitario.

GCET2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GCSAM senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GCET2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GCSAM nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GCSAM, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GCET2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GCSAM nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GCET2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GCET2 nelle cellule tumorali con espressione di GCSAM silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.