Gas1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404384-ACT

Humanes GAS1 (growth arrest specific 1) kodiert ein GPI-verankertes Zelloberflächenprotein, das die Morphogensignalgebung und die Kontrolle des Zellzyklus moduliert und eine wichtige Rolle bei der Musterbildung während der Entwicklung sowie bei der Regulation der Proliferation spielt. Gas1 kann die Aktivität des Hedgehog-Signalwegs über Interaktionen mit Liganden und Rezeptoren an der Plasmamembran beeinflussen und so extrazelluläre Signale mit Transkriptionsprogrammen verknüpfen, die Differenzierung und Wachstumsarrest steuern. Eine veränderte GAS1-Expression wurde mit einer fehlregulierten Hedgehog-Signalgebung und mit Veränderungen von Zellschicksalsentscheidungen in Verbindung gebracht – Prozesse, die häufig in der Neuroentwicklung, der Gewebehomöostase und der Tumorbiologie untersucht werden. Als membranständiger Regulator ist GAS1 außerdem relevant für die Untersuchung der Rezeptororganisation, der Festlegung von Signalschwellen und des kontextabhängigen Crosstalks zwischen Signalwegen.

Gas1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GAS1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Gas1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GAS1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GAS1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Gas1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GAS1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Gas1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Gas1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GAS1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.