G2E3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405720-ACT

Il gene umano G2E3 codifica una ligasi E3 ubiquitina-proteina di tipo RING, implicata nella proteostasi dipendente dall’ubiquitina e nel controllo del ciclo cellulare sensibile allo stress. Promuovendo l’ubiquitinazione selettiva di proteine regolatorie, G2E3 è in grado di influenzare la segnalazione del danno al DNA, la progressione dei checkpoint e i processi legati all’apoptosi che determinano la sopravvivenza cellulare in condizioni di stress genotossico o da replicazione. Una regolazione alterata delle reti di ligasi ubiquitina che includono G2E3 è stata associata a fenotipi di instabilità genomica e a programmi proliferativi deregolati osservati in diversi contesti rilevanti per la malattia. Di conseguenza, G2E3 è spesso studiato per il suo contributo al crosstalk tra la segnalazione ubiquitina-dipendente, la dinamica del ciclo cellulare e le risposte trascrizionali allo stress cellulare.

G2E3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di G2E3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

G2E3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus G2E3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione G2E3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di G2E3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus G2E3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da G2E3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via G2E3 nelle cellule tumorali con espressione di G2E3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.