Fucokinase Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-409449-ACT

Il gene umano **FUK** codifica la fucokinasi, una chinasi citosolica che fosforila la **L-fucosio** a **fucosio-1-fosfato**, avviando la via di recupero (salvage) della L-fucosio che ripristina il **GDP-fucosio** necessario per le reazioni di fucosilazione. Sostenendo l’omeostasi degli zuccheri nucleotidici, la fucokinasi contribuisce ai processi di glicosilazione associati al Golgi e al reticolo endoplasmatico (ER), che regolano il ripiegamento proteico, la segnalazione recettoriale e le interazioni cellula–cellula. Alterazioni del metabolismo del fucosio e una fucosilazione disregolata sono state associate a cambiamenti nella modulazione immunitaria, nell’infiammazione e nelle firme glicani tipiche dei tumori, rendendo **FUK** un nodo utile per studiare il controllo glicometabolico dei fenotipi cellulari. La modulazione sperimentale dell’espressione di **FUK** può aiutare a chiarire come il GDP-fucosio derivato dalla via di recupero influenzi il rimodellamento di glicoproteine e glicolipidi in contesti di stress e differenziamento.

Fucokinase Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FUK senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Fucokinase Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FUK nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FUK, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Fucokinase. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FUK nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Fucokinase nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Fucokinase nelle cellule tumorali con espressione di FUK silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.