fetuin-A Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401125-ACT

AHSG codifica fetuina-A, una glicoproteina secreta dal fegato che circola in elevate quantità e modula la segnalazione extracellulare legandosi a ioni minerali e a diversi ligandi. La fetuina-A partecipa alla regolazione della biomineralizzazione e della calcificazione formando complessi solubili con calcio e fosfato, e può influenzare la segnalazione recettoriale e l’attività delle proteasi nel microambiente extracellulare. In contesti metabolici e infiammatori, la fetuina-A è stata collegata alla modulazione della segnalazione del recettore dell’insulina, all’attivazione immunitaria associata ai lipidi e alla comunicazione endocrina epatica. Un’espressione disfunzionale di AHSG o livelli alterati di fetuina-A sono stati associati a tratti cardiometabolici, stati infiammatori cronici e fenotipi di calcificazione ectopica, rendendola un nodo utile per lo studio delle vie della omeostasi sistemica.

fetuin-A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di AHSG senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

fetuin-A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus AHSG nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione AHSG, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di fetuin-A. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus AHSG nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da fetuin-A nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via fetuin-A nelle cellule tumorali con espressione di AHSG silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.