FBL10 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403232-ACT

KDM2B (auch bekannt als FBL10) kodiert eine Histon-Demethylase mit JmjC-Domäne, die an der epigenetischen Regulation der Transkription über Chromatin-Remodeling beteiligt ist. Das Protein wird mit Polycomb-assoziierter Genrepression sowie mit der Modulation von Zellzyklus- und Differenzierungsprogrammen in Verbindung gebracht, indem es die Methylierungszustände promotorassoziierter Histone steuert. Über diese Aktivitäten beeinflusst KDM2B/FBL10 die Aufrechterhaltung von Stammzell-Eigenschaften, die Festlegung von Zelllinien (Lineage Commitment) und die zelluläre Seneszenz und verknüpft seine Fehlregulation mit veränderten proliferativen Signalen und aberranten Transkriptionsnetzwerken. Störungen der KDM2B-Expression oder -Funktion wurden in verschiedenen krebsrelevanten Kontexten und Entwicklungsphänotypen beschrieben, wodurch es sich als geeigneter Knotenpunkt für die Untersuchung der chromatinabhängigen Kontrolle der Genexpression anbietet.

FBL10 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen KDM2B-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

FBL10 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des KDM2B-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der KDM2B-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen FBL10-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native KDM2B-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von FBL10-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des FBL10-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem KDM2B-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.