FANCB Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-417439-ACT

FANCB codifica um componente central da via de reparo de DNA da anemia de Fanconi (AF), que protege a integridade do genoma durante a fase S ao promover o reparo de ligações cruzadas intercadeias no DNA. Dentro do complexo central de AF, o FANCB auxilia a montagem e a atividade do módulo de ligase E3 de ubiquitina que monoubiquitina FANCD2 e FANCI, permitindo a coordenação a jusante com mecanismos de recombinação homóloga e de proteção da forquilha de replicação. A ruptura ou disfunção de FANCB compromete a rede AF/BRCA, aumentando o estresse replicativo, a instabilidade cromossômica e a sensibilidade a danos por agentes indutores de ligações cruzadas. Variações patogênicas em FANCB estão associadas à anemia de Fanconi e a fenótipos relacionados de desenvolvimento e falência da medula óssea, tornando a regulação de FANCB uma ferramenta útil para o estudo de respostas a danos no DNA.

FANCB O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de FANCB sem alterar a sequência de ADN subjacente.

FANCB O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus FANCB em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição FANCB, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de FANCB. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus FANCB nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de FANCB no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via FANCB em células tumorais com expressão de FANCB silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.