FANCB CRISPR Activation Plasmid (h): sc-417439-ACT

FANCB kodiert eine zentrale Komponente des Fanconi-Anämie(FA)-DNA-Reparaturwegs, der während der S-Phase die Genomintegrität schützt, indem er die Reparatur von DNA-Interstrangvernetzungen fördert. Innerhalb des FA-Core-Komplexes unterstützt FANCB den Aufbau und die Aktivität des E3-Ubiquitin-Ligase-Moduls, das FANCD2 und FANCI monoubiquitinyliert und dadurch die nachgeschaltete Koordination mit Mechanismen der homologen Rekombination und des Schutzes der Replikationsgabel ermöglicht. Eine Störung oder Fehlfunktion von FANCB beeinträchtigt das FA/BRCA-Netzwerk, erhöht Replikationsstress, chromosomale Instabilität und die Empfindlichkeit gegenüber vernetzenden DNA-Schädigungen. Pathogene Varianten in FANCB sind mit Fanconi-Anämie sowie verwandten Entwicklungsstörungen und Knochenmarkversagen-Phänotypen assoziiert, wodurch die Regulation von FANCB einen nützlichen Ansatzpunkt für die Untersuchung von DNA-Schadensantworten darstellt.

FANCB Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen FANCB-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

FANCB Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des FANCB-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der FANCB-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen FANCB-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native FANCB-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von FANCB-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des FANCB-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem FANCB-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.