Exportin 5 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403402-ACT

XPO5 codifica per Exportin 5, un recettore di esportazione nucleare dipendente da RanGTP che trasporta pre-miRNA e alcuni RNA strutturati selezionati dal nucleo al citoplasma, consentendone la successiva elaborazione da parte di DICER e l’assemblaggio dei complessi di silenziamento indotti da RNA. Controllando l’apporto di pre-miRNA alla via citoplasmatica di biogenesi dei miRNA, Exportin 5 influenza la regolazione genica post-trascrizionale, i programmi di differenziamento cellulare, le risposte allo stress e la proliferazione. Alterazioni dell’espressione di XPO5 o della sua attività di trasporto possono rimodellare i profili globali di miRNA e le reti trascrizionali a valle, rendendolo rilevante per studi sulla segnalazione oncogenica, sui fenotipi associati alla metastasi e sulla stabilità del genoma. Exportin 5 interagisce inoltre con processi più ampi di trasporto nucleo-citoplasmatico coordinati dal ciclo di Ran, collegando il traffico dell’RNA all’organizzazione nucleare e all’omeostasi dell’espressione genica.

Exportin 5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di XPO5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Exportin 5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus XPO5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione XPO5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Exportin 5. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus XPO5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Exportin 5 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Exportin 5 nelle cellule tumorali con espressione di XPO5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.