EphB4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401122-ACT

EPHB4 codifica EphB4, una tirosin-chinasi recettoriale che si lega a ligandi ephrin-B ancorati alla membrana per mediare una segnalazione dipendente dal contatto durante lo sviluppo vascolare embrionale, la specificazione venosa e la definizione dei pattern tissutali. L’attività di EphB4 regola il clustering dei recettori, l’autofosforilazione e vie a valle che includono le GTPasi della famiglia Rho, MAPK/ERK, PI3K/AKT e la segnalazione Src/FAK, coordinando migrazione endoteliale, adesione cellulare e formazione di confini. Nei tessuti adulti, la segnalazione di EphB4 contribuisce al rimodellamento angiogenico e alle interazioni perivascolari; una sua deregolazione è stata riportata in molteplici contesti tumorali e in anomalie vascolari. In quanto nodo di via che collega la comunicazione cellula-cellula alla dinamica del citoscheletro, EPHB4 è spesso studiato in modelli di angiogenesi, invasione e crosstalk con il microambiente.

EphB4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EPHB4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

EphB4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EPHB4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EPHB4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di EphB4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EPHB4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da EphB4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via EphB4 nelle cellule tumorali con espressione di EPHB4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.