EphB2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401642-ACT

EPHB2 codifica la tirosin-chinasi recettoriale umana EphB2, membro del sistema di segnalazione Eph/ephrin che media una comunicazione dipendente dal contatto e controlla il posizionamento cellulare, la formazione di confini e la guida assonale. L’attivazione di EphB2 da parte di ligandi ephrin-B regola il rimodellamento del citoscheletro, le dinamiche di adesione e la migrazione attraverso vie che coinvolgono le GTPasi della famiglia Rho, la segnalazione MAPK e reti correlate a PI3K. Nei tessuti dei mammiferi, EphB2 contribuisce alla definizione dei pattern di sviluppo e al mantenimento dell’architettura epiteliale; inoltre, una segnalazione EphB2 deregolata è stata implicata in alterazioni dell’invasività e degli stati di differenziamento nella biologia dei tumori. EPHB2 è anche studiato nel contesto dei processi di neurosviluppo e dell’organizzazione sinaptica, in cui interazioni recettore–ligando a gradiente influenzano la formazione dei circuiti.

EphB2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EPHB2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

EphB2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EPHB2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EPHB2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di EphB2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EPHB2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da EphB2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via EphB2 nelle cellule tumorali con espressione di EPHB2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.