ENX-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-417028-ACT

EZH2 codifica la proteina umana ENX-1, la subunità catalitica del Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2), che trimetila l’istone H3 sulla lisina 27 (H3K27me3) per stabilire una cromatina a trascrizione repressa. Attraverso il silenziamento mediato da Polycomb, ENX-1 regola la specificazione di linea, il controllo del ciclo cellulare e il mantenimento dell’identità cellulare modulando l’accessibilità della cromatina e programmi epigenetici a lungo raggio. La repressione dipendente da EZH2 si intreccia con vie chiave che controllano proliferazione e differenziamento, inclusi il rimodellamento della cromatina e le reti trascrizionali dello sviluppo. Un’attività di EZH2 deregolata e paesaggi di metilazione di H3K27 alterati sono spesso associati a stati trascrizionali oncogenici e a rimodellamenti epigenetici rilevanti per la malattia, a supporto del suo impiego come gene modello nella ricerca sul cancro e sulla biologia della cromatina.

ENX-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EZH2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ENX-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EZH2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EZH2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ENX-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EZH2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ENX-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ENX-1 nelle cellule tumorali con espressione di EZH2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.