EN1/Engrailed 1 Particelle di Attivazione Lentivirale (m): sc-420171-LAC

En1 codifica il fattore di trascrizione homeobox EN1/Engrailed 1, un regolatore di legame al DNA specifico per sequenza essenziale per la patterning del confine mesencefalo–rombencefalo, lo sviluppo del cervelletto e l’instaurarsi dell’identità dei sottotipi neuronali nel topo. EN1 modula le reti regolatorie geniche dello sviluppo coordinando programmi trascrizionali che influenzano la specificazione del destino cellulare, la morfogenesi e la guida assonale. Nei tessuti differenziati, EN1 contribuisce al mantenimento dei circuiti neurali e alle risposte allo stress cellulare attraverso un ampio controllo trascrizionale della sopravvivenza neuronale e della funzione sinaptica. Un’espressione o un’attività deregolate di EN1 vengono impiegate come strumento di ricerca per studiare difetti del neurosviluppo, la formazione dei circuiti e meccanismi rilevanti per la neurodegenerazione e la riprogrammazione trascrizionale oncogenica.

Le particelle di attivazione lentivirale EN1/Engrailed 1 (m) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di En1 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale EN1/Engrailed 1 (m) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione En1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di EN1/Engrailed 1. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo En1 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.