Elk-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400385-ACT

ELK1 codifica Elk-1, un fattore di trascrizione con dominio ETS che funge da effettore nucleare della segnalazione mediata da chinasi attivate da mitogeni, in particolare a valle di ERK/MAPK. Dopo la fosforilazione, Elk-1 coopera con il serum response factor sugli elementi di risposta al siero (serum response elements) per regolare programmi di trascrizione dei geni a risposta immediata che controllano proliferazione, differenziamento, plasticità sinaptica e risposte allo stress cellulare. L’attività di ELK1 integra segnali provenienti dai recettori per i fattori di crescita e da altre vie chinasi per plasmare output trascrizionali specifici del contesto, rendendolo un nodo utile per studiare la regolazione genica dipendente dal segnale. La deregolazione della segnalazione di Elk-1 e dell’espressione dei suoi geni bersaglio è stata implicata in programmi trascrizionali oncogenici e in fenotipi legati alla neurobiologia, a supporto della sua rilevanza nella modellizzazione meccanicistica delle malattie.

Elk-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ELK1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Elk-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ELK1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ELK1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Elk-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ELK1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Elk-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Elk-1 nelle cellule tumorali con espressione di ELK1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.