eIF3γ Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-418339-ACT

EIF3H codifica la subunità gamma del fattore eucariotico di inizio della traduzione 3 (eIF3γ), un componente centrale del complesso eIF3 che coordina il reclutamento della subunità ribosomiale 40S, il caricamento dell’mRNA e il riconoscimento del codone di inizio durante l’avvio della traduzione dipendente dal cap. Regolando la sintesi proteica globale e selettiva per specifici trascritti, eIF3γ influenza la crescita cellulare, le risposte allo stress e la proteostasi, intersecandosi con vie come la segnalazione mTOR e i programmi della risposta integrata allo stress che modulano l’output traduttivo. Un’alterazione della funzione del complesso eIF3 è stata collegata a un controllo della traduzione deregolato osservato in stati cellulari proliferativi e adattativi allo stress, a supporto dell’indagine di EIF3H in modelli rilevanti per la malattia in cui la riprogrammazione traduttiva contribuisce al fenotipo.

eIF3γ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EIF3H senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

eIF3γ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EIF3H nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EIF3H, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di eIF3γ. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EIF3H nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da eIF3γ nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via eIF3γ nelle cellule tumorali con espressione di EIF3H silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.