EHD Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-407060-ACT

L’EHD1 umano (Eps15 homology domain-containing protein 1) codifica un’ATPasi della famiglia di proteine EHD che coordina il rimodellamento delle membrane endocitiche e il riciclo dei recettori internalizzati verso la membrana plasmatica. EHD1 regola il traffico a partire dagli endosomi tubulari e interagisce con il trasporto mediato da Rab, la dinamica dell’actina e la curvatura di membrana dipendente dai fosfoinositidi, influenzando la disponibilità dei recettori e la durata della segnalazione. Attraverso il controllo del riciclo del carico, EHD1 incide su processi quali la migrazione cellulare, l’assorbimento di nutrienti e l’espressione di superficie di molecole di adesione e recettori per fattori di crescita. Alterazioni del riciclo endocitico e dei programmi di traffico recettoriale che coinvolgono EHD1 sono state associate a fenotipi rilevanti per la segnalazione proliferativa e il comportamento invasivo nella biologia del cancro, nonché a una più ampia disregolazione del trasporto di membrana in contesti di malattie complesse.

EHD1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EHD1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

EHD1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EHD1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EHD1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di EHD1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EHD1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da EHD1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via EHD1 nelle cellule tumorali con espressione di EHD1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.