EB1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401367-ACT

Il gene umano MAPRE1 codifica per l’end-binding protein 1 (EB1), un fattore chiave che si associa alle estremità “plus” dei microtubuli e coordina la dinamica dei microtubuli con la cattura corticale, l’assemblaggio del fuso mitotico e la segregazione dei cromosomi. EB1 interagisce con APC e con altre proteine +TIP per regolare la crescita dei microtubuli, la polarità cellulare e il traffico intracellulare, collegando il rimodellamento del citoscheletro al controllo del ciclo cellulare. La deregolazione di MAPRE1/EB1 è stata associata ad alterazioni della fedeltà mitotica, aneuploidia e comportamento cellulare invasivo, rendendolo rilevante per lo studio delle vie alla base di fenotipi proliferativi e migratori. Il suo ruolo centrale nei processi dipendenti dai microtubuli supporta inoltre ricerche meccanicistiche sulla funzione del centrosoma e sulla regolazione del checkpoint del fuso.

EB1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MAPRE1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

EB1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MAPRE1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MAPRE1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di EB1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MAPRE1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da EB1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via EB1 nelle cellule tumorali con espressione di MAPRE1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.