EAR2 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-420216-ACT

Il gene murino **Nr2f6** codifica il recettore nucleare orfano **EAR2 (NR2F6)**, un fattore di trascrizione indipendente dal ligando che si lega agli elementi di risposta ormonale per regolare programmi genici che controllano differenziamento, metabolismo e omeostasi immunitaria. EAR2 si integra nelle reti di segnalazione dei recettori nucleari e può modulare gli output trascrizionali a valle di stimoli infiammatori e di vie di sviluppo, includendo un crosstalk dipendente dal contesto con i circuiti dei recettori dei retinoidi e degli steroidi. Nelle cellule immunitarie, l’attività di NR2F6 è stata associata alla modulazione dell’espressione delle citochine e delle funzioni effettrici delle cellule T, rendendolo rilevante per lo studio dei meccanismi di tolleranza immunitaria e dell’infiammazione cronica. Un’espressione deregolata di NR2F6/EAR2 è stata riportata in molteplici firme trascrizionali associate a malattie, supportandone l’impiego in modelli di biologia del cancro, autoimmunità e rimodellamento tissutale.

EAR2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Nr2f6 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

EAR2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Nr2f6 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Nr2f6, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di EAR2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Nr2f6 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da EAR2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via EAR2 nelle cellule tumorali con espressione di Nr2f6 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.