DRP1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400459-ACT

DNM1L codifica la proteina 1 correlata alla dynamina (DRP1), una grande GTPasi che coordina la fissione dei mitocondri e dei perossisomi assemblandosi sulle membrane degli organelli e contraendole in coordinamento con proteine adattatrici quali MFF, MID49/51 e FIS1. Attraverso il controllo della morfologia degli organelli, DRP1 influenza la bioenergetica, la mitofagia, la segnalazione dell’apoptosi e la ridistribuzione dei mitocondri durante la divisione cellulare e il trasporto neuronale. L’attività di DRP1 è integrata con le vie di risposta allo stress ed è regolata da fosforilazione, SUMOilazione, ubiquitinazione e S-nitrosilazione, collegando la segnalazione cellulare alle dinamiche mitocondriali. Una funzione disregolata di DNM1L/DRP1 è implicata in fenotipi neurosviluppativi e neurodegenerativi, disfunzioni cardiometaboliche e rimodellamento metabolico associato al cancro, rendendola un nodo chiave per studi meccanicistici dell’omeostasi mitocondriale.

DRP1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DNM1L senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DRP1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DNM1L nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DNM1L, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DRP1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DNM1L nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DRP1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DRP1 nelle cellule tumorali con espressione di DNM1L silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.